in situ hybridizace je metoda pro detekci chromozomálních aberací. Některé chromozomy jsou označeny fluorescenčními barvivy a vázány na DNA sondu. Tato technika se používá pro prenatální diagnostiku genových mutací.
Co je to hybridizace in situ?
V případě hybridizace in situ nebo Fluorescenční in situ hybridizace nukleové kyseliny z RNA nebo DNA jsou detekovány v určitých tkáních nebo buňkách pomocí molekulárně genetických metod. Obvykle se tento typ diagnózy používá k detekci strukturální nebo numerické chromozomální abnormality během těhotenství.
K tomuto účelu se používá uměle vyrobená sonda, která sama o sobě sestává z nukleové kyseliny. Pak se váže na nukleové kyseliny v organismu prostřednictvím párování bází. Tato vazba je míněna termínem hybridizace. Důkazy jsou založeny na živé struktuře pacienta, a proto odpovídají důkazům na místě. To je třeba odlišit od metod in vitro, ve kterých se detekce provádí ve zkumavce. Tuto metodu vyvinuli vědci Joe Gall a Mary Lou Pardue ve 20. století.
Technologie se od té doby vyvinula. Zatímco v té době byly použity radioaktivní sondy, dnes se dnes používají například fluorescenčně značené sondy s kovalentní vazbou na markerové molekuly.
Funkce, účinek a cíle
Hybridizace in situ se obvykle používá k detekci chromozomálních aberací, tj. Chromozomálních anomálií, které nelze detekovat v karyogramu. To znamená, že tato metoda se používá vždy, když mají být v průběhu těhotenství stanovena dědičná onemocnění.
Protože chromozomové aberace jsou problémem, který by se dnes neměl podceňovat, používání této metody se časem zvyšuje. Hybridizace probíhá na základě nativních buněk z plodové vody matky. Základem technologie je vazba barevné sondy na části DNA. Díky vázání lze počet kopií později vyhodnotit pomocí mikroskopu, protože jednotlivé kopie vydávají světelný signál, a mohou být tedy pod mikroskopem zviditelněny. Existují různé postupy. Analýza se provádí okamžitě po navázání.
V tomto případě se použije fluorescenční barvivo, jako je biotin, které se váže přímo na DNA sondu. U nepřímé metody in situ hybridizace nemůže být vyhodnocení provedeno okamžitě po hybridizaci, protože fluorescenční látky se mohou k hybridizaci vázat pouze po hybridizaci. Tato nepřímá metoda se používá častěji než metoda přímá, protože se považuje za citlivější. Kromě chromozomově specifických centrometrických DNA sond existují také lokusově specifické DNA sondy, chromosomově specifické DNA knihovní sondy a srovnávací hybridizace genomu.
Chromozomově specifické centrometrové DNA sondy lze použít k detekci chromozomálních numerických anomálií. To znamená, že se používají hlavně v případě podezření na duplikované nebo odstraněné chromozomy. Místně specifické DNA sondy jsou zvláště vhodné pro detekci minimálních mutací, které nelze detekovat v karyogramu. Chromosomově specifická sonda DNA knihovny se používá zejména pro detekci inzercí a translokací.
Srovnávací hybridizace genomu je naproti tomu komplexní analýzou ztrát a zisků v chromozomálním materiálu. Dnes je in-situ hybridizace velmi důležitá při diagnostice různých chromozomových mutací.Například při diagnostice Downova syndromu se sondy vážou na chromozom 21. K tomuto účelu se obvykle používají sondy specifické pro chromozom, které mohou být použity v případě podezření na toto onemocnění.
K podezření může dojít například v případě, že rodiče dříve porodili dítě s onemocněním a ultrazvukový obraz je neobvyklý. Pokud namísto dvojné vazby existuje trojnásobná vazba, a tak je vydán trojitý barevný signál, je diagnóza považována za potvrzenou.
Rizika, vedlejší účinky a nebezpečí
Na rozdíl od například PCR je hybridizace in situ výrazně méně náchylná ke kontaminaci. Kromě toho je doba potřebná pro proces značně kratší. Protože však embrya zejména vytvářejí chromozomové vzorce, nelze z daného vzorce odvodit zbytek chromozomální distribuce a tedy genetický stav jiných buněk.
Barevné signály se mohou také překrývat nebo zůstat neviditelné z jiných důvodů. Výsledkem je, že hybridizace in situ jako diagnostický nástroj je relativně náchylný k chybám během těhotenství. Mohou vzniknout mylné diagnózy a rodiče se mohou rozhodnout proti zdravému embryu. Aby se snížila citlivost na chyby hybridizace in situ, měly by být současně vyšetřeny nejméně dvě embryonální buňky. Souběžným zkoumáním dvou buněk nyní existuje jen zanedbatelné riziko nesprávné diagnózy.
V takovém případě se mohou rodiče na diagnózu spolehnout. Hybridizace in situ není nabízena každé těhotné ženě, ale pouze ženám z rizikové skupiny. Těhotným ženám však není tento typ diagnózy na vlastní žádost odepřen. Abnormální nálezy ultrazvuku nebo abnormální sérum mohou přimět lékaře, aby nabídl diagnostický postup. Ačkoli velká část, ale v žádném případě ne všechny, chromozomových aberací může být diagnostikována pomocí in-situ hybridizace.
Hybridizace in situ proto nesmí být nikdy prováděna samostatně, ale vždy musí být použita ve spojení s konvenčním chromozomovým testem. V tomto postupu hraje hlavní roli péče o těhotnou ženu. Před analýzou probíhá podrobná diskuse s nastávající matkou o diagnostické metodě, která vysvětluje rizika, možnosti a limity technologie.
.jpg)
.jpg)
.jpg)
